一、非靶向代谢组学
非靶向代谢组学是一种全面、无偏的分析策略，旨在对生物样本中所有可检测的小分子代谢物进行全谱检测，无需预先设定分析目标。该技术结合高分辨率质谱平台（如液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用）以及多种色谱分离方法（如反相色谱、亲水色谱 ），可实现对已知与未知代谢物的定性及半定量分析。
Khoomrung, S. et al. Front Pharmacol. 2017.
图1. 非靶向代谢组学分析流程
非靶向代谢组学可涵盖多类关键代谢物，如氨基酸、有机酸、脂类、胆固醇、脂肪酸、糖类和核苷酸。通过高效的样本处理流程与精密仪器平台，非靶向代谢组学可用于全面监测不同生理或病理状态下的代谢物变化，广泛应用于基础医学研究、临床研究、微生物学与营养科学等领域。
二、血浆代谢组学
血浆是代谢组学中最常用的样本类型之一，能够反映多个器官与系统的整体代谢状态。由于血浆含有高丰度的蛋白和脂类，其样本前处理的关键在于高效提取低丰度代谢物并去除干扰成分。常用策略包括有机溶剂（如甲醇）沉淀蛋白，辅以固相萃取（SPE）、膜过滤或在线蛋白去除系统以提升信噪比。对于极性差异显著的代谢物，还可采用双相萃取法实现极性与非极性代谢物的分离，利于脂质类和亲水性小分子的并行分析。
Wawrzyniak, R. et al. Sci Rep. 2018.
图2. 血浆代谢组学样品处理流程
在分离与检测方面，非靶向代谢组学采用高分辨率液相色谱-质谱联用技术（LC-HRMS）进行代谢物分析。通过多模式分离策略，如反相色谱和亲水作用色谱，可覆盖多种代谢物，确保对低丰度代谢物的全面检测。质谱部分通常采用如 Orbitrap 或 Q-TOF 等高分辨率质谱仪，能够精确测定代谢物的质荷比（m/z），并进行初步结构识别。结合依赖数据采集（DIA）与非依赖数据采集（DDA）模式，该方法进一步提升了未知代谢物的识别能力，确保数据的完整性与准确性。
三、粪便代谢组学
粪便代谢组学广泛应用于炎症性肠病、代谢综合征、肝肠轴研究等领域，是连接肠道微生物组与宿主代谢的重要研究工具。处理流程通常包括冷冻研磨、均质化、极性或混合有机溶剂（如甲醇、水、异丙醇）提取代谢物。可根据研究需求选择单相或双相萃取策略。高通量离心、过滤用于去除颗粒物，有时结合冷冻干燥以浓缩样本并增强检测灵敏度。
Karu, N. et al. Anal Chim Acta. 2018.
图3. 粪便代谢组学中样品处理流程
在分离与检测方面，粪便代谢组学通常将反相色谱与亲水色谱相结合，并联用高分辨率质谱（如 Orbitrap 或 Q-TOF）进行全扫描分析。该方法可覆盖多种代谢物类型，包括短链脂肪酸、胆汁酸、吲哚类化合物、脂质、苯丙素类化合物及微生物特异性代谢产物。由于粪便样本基质复杂、个体间差异大，数据分析通常需要引入稳定的内标物、批次效应校正以及多变量统计方法，以保证结果的可比性与生物学解读的准确性。
四、细菌代谢组学
细菌代谢组学用于探索微生物代谢通路、菌株功能及其对外部刺激（如药物、环境）的响应，分为胞内和胞外代谢物分析。胞内代谢物处理包括迅速终止代谢（如使用冷溶剂），并通过玻璃珠破碎或冻融法裂解细胞。胞外代谢物则通过离心去除细胞后，从培养上清中提取，常结合固相萃取纯化。
Mohd, Kamal, K. et al. Biochem Res Int. 2022.
图4. 细菌代谢组学中样品处理流程
对于血浆、粪便与细菌样本的代谢物检测，非靶向代谢组学均采用高分辨率质谱（如 Orbitrap 或 Q-TOF）联用多模式色谱方法进行全扫描检测。为确保数据可比性与生物学解读，通常需结合内标校正、批次效应处理及多变量统计分析。
五、代谢物分析
1、脂质分析
在非靶向代谢组学中，脂质组学通过全面分析脂质的多样性和动态变化，揭示脂质在疾病发展中的关键角色。样品提取是脂质组学中的关键步骤，常用的提取方法包括Folch法和Bligh-Dyer法，它们能有效从细胞或组织样本中提取脂质。此外，超临界流体萃取（SFE）作为一种新兴技术，能高效提取低丰度脂质，减少传统溶剂的使用并提高脂质回收率。脂质鉴定方法中，除了常见的质谱技术外，液相色谱-串联微流控芯片技术（LC-MC）通过微流控芯片与液相色谱的结合，提升了脂质分离的效率，特别适用于复杂样本的高通量筛查。二维液相色谱（2D-LC）则结合不同的分离机制，能显著提高脂质的分辨率，从而更精确地分析复杂脂质样本。核磁共振（NMR）技术也被应用于脂质组学，能够提供脂质分子的空间结构信息，尤其适用于复杂脂质的定性分析。脂质组学的这些新型技术，使脂质的检测更为精确，推动了脂质在疾病研究和生物标志物发现中的应用。
Ahluwalia, K. et al. Metabolites. 2022.
图5. 脂质组学分析流程
2、氨基酸分析
非靶向氨基酸分析的难点主要在于结构类似物（如同分异构体）难以区分、部分氨基酸极性强导致保留性能差，以及易受基质干扰影响定量准确性。为确保分析质量，需在前处理阶段优化蛋白沉淀和衍生化策略，提高目标化合物的提取效率与信号响应；色谱分离阶段需选择合适的反相或亲水作用色谱柱以提升解析度；质谱检测中应采用高分辨和高精度仪器，结合多级质谱信息增强结构判别能力。此外，数据处理阶段需严格筛选背景噪声和误配结果，确保差异氨基酸的准确识别与代谢路径注释。
3、胆汁酸分析
胆汁酸在非靶向代谢组学分析中作为重要的代谢物，常通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行检测。LC-MS可以高效分离胆汁酸的多种异构体，如原胆酸、去氧胆酸及其衍生物，并提供定性定量分析。通过非靶向分析，研究人员能够识别不同病理状态下胆汁酸的代谢变化，揭示其在代谢紊乱或疾病进程中的潜在作用。非靶向分析相比靶向分析具有更广泛的覆盖面，能够在没有预设目标物的情况下发现新的胆汁酸代谢物，提升研究的全面性。这为胆汁酸在疾病诊断中的应用，特别是在肝病、代谢疾病中的潜在标志物发现，提供了有力的数据支持。
Marques, CF. et al. Separations. 2023.
图6. 代谢物非靶向代谢组学分析流程
六、代谢通路分析
代谢通路分析是非靶向代谢组学中至关重要的一环，旨在将检测到的代谢物映射到已知的生物代谢通路，识别在特定条件下显著扰动的代谢网络。分析过程包括代谢物注释、通路匹配、富集分析和影响因子评估。通过整合代谢物变化、通路拓扑结构和网络关键节点，揭示潜在的生物机制，为疾病研究、药物开发和营养干预提供深入见解。
Han, J. et al. Front Mol Biosci. 2021.
图7. 代谢通路分析流程
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